Institut Fresnel

Les techniques dites de Raman Cohérent permettent de visualiser des groupements chimiques présents dans les échantillons sans utiliser aucun marquage. Il s’agit d’utiliserdeux faisceaux lasers dont la différence de fréquence est égale à la fréquence de vibration de la liaison chimique que l’on veut visualiser.

L’approche conventionnelle utilise des lasers focalisés en un point qui balayent l’échantillon à l’aide de miroir mobiles, l’image est alors reconstruite point par point et est limitée par le temps nécessaire aux faisceaux lasers pour balayer l’échantillon. Augmenter la vitesse de balayage implique l’augmentation de la puissance des lasers ce qui conduit inévitablement à un photo-endommagement de l’échantillon.

Des chercheurs de l’Institut Fresnel à Marseille, en collaboration avec des collègues lithuaniens et américains ont récemment développé une nouvelle méthode pour imager les groupements chimiques des molécules n’utilisant pas un balayage laser de l’échantillon mais une imagerie en champ large utilisant une caméra. Pour cela, ils ont utilisé une illumination de l’échantillon avec des tavelures (speckle) aléatoires qui ont l’avantage de garder leurs propriétés statistiques lorsqu’elles se propagent dans un milieu diffusant comme les tissues biologiques. En changeant les illuminations de speckle ils ont pu démontrer (1) qu’il est possible d’imager des liaisons chimiques ne se trouvant que dans le plan d’imagerie, réalisant ainsi un sectionnement optique virtuel, et (2) qu’il est possible d’améliorer la résolution d’un facteur 2. Par ailleurs ce mode d’illumination permet de préserver l’échantillon des endommagements liés à l’illumination laser et permettre ainsi d’imager l’échantillon sur le long terme.

Ce nouveau mode d’imagerie doit permettre d’avancer les recherches dans les domaines de la biologie, de la pharmacologie et de la médecine, en particulier pour détecter rapidement les tissus cancéreux.

Référence : E. M. Fantuzzi, S. Heuke, S. Labouesse, D. Gudavičius, R. Bartels, A. Sentenac, and H. Rigneault, "Wide-field coherent anti-Stokes Raman scattering microscopy using random illuminations" Nature Photonics (2023).
 DOI : 10.1038/s41566-023-01294-x

- Voir aussi l’article "Imagerie moléculaire vibrationnelle un nouvel outil pour la biologie et la médecine" dans le revue Photoniques, N°96, Mai-Juin 2019 (p.18 à 22)

Financement : ERC AdG SpeckleCARS (101052911) - EU ICT 101016923 CRIMSON, Marie Skłodowska-Curie Actions ITN 812992 MUSIQ

Contact : herve.rigneault@fresnel.fr, sandro.heuke@fresnel.fr, anne.sentenac@fresnel.fr

Imagerie de la structure interne d’un analogue d’astéroïde à partir de mesures micro-ondes

Cette étude concerne l’imagerie de la structure interne des astéroïdes et a été réalisée sur un analogue de l’astéroïde (25143) Itokawa, un astéroïde rencontré par la mission Hayabusa de l’agence spatiale japonaise JAXA en 2005.
Ces travaux ont été conduits dans le cadre d’une collaboration entre des chercheurs du département de mathématiques et de statistiques de l’université de Tampere en Finlande et des chercheurs de l’Institut Fresnel à Marseille. Ils ont donné lieu à deux articles conjoints publiés dans la revue Astronomy & Astrophysics. Dans ces articles, une étude des procédures d’imagerie exploitant l’interaction des ondes électromagnétiques avec les astéroïdes est proposée avec l’idée de faire progresser le développement des techniques d’inversion à utiliser pour les futures études radar de science planétaire ciblant les petits corps du système solaire (SSSB). La configuration la plus courante pour les radars spatiaux, une configuration monostatique, a été choisie.
Deux analogues de cet astéroïde ont été construits par impression 3D, en respectant autant que possible les connaissances actuelles sur cet astéroïde. Des mesures de diffraction par ces analogues dans la gamme de fréquences des micro-ondes ont été effectuées dans un environnement de laboratoire contrôlé (chambre anéchoïque, figure 1). Nous avons étudié la possibilité d’imager la structure interne de ces analogues avec deux procédures différentes, l’une dans le domaine fréquentiel (partie 1 de l’étude) et l’autre dans le domaine temporel (partie 2 de l’étude). Toutes les inversions ont été effectuées en utilisant le même jeu mesures. Les résultats montrent qu’avec ces deux approches, il est possible d’obtenir la structure interne des analogues et de l’imager à partir de ces mesures de type radar monostatique (figures 2 et 3). Ceci est encourageant pour pouvoir exploiter les données des futures missions avec radar vers les astéroides, comme la mission HERA de l’ESA, avec à son bord un radar, dont le départ est prévu l’année prochaine vers l’astéroïde binaire (65803) Didymos.

Référence :
[1] A. Dufaure, C. Eyraud, L-I. Sorsa, Y.O. Yusuf, S. Pursiainen, and J-M. Geffrin, Imaging of the internal structure of an asteroid analogue from quasi-monostatic microwave measurements. Part 1 : The frequency domain approach., Astronomy & Astrophysics, Vol. 674, art. A72, june 2023
[2] L.-I. Sorsa, Y.O. Yusuf, A. Dufaure, J-M. Geffrin, C. Eyraud and S. Pursiainen, Imaging of the internal structure of an asteroid analogue from quasi-monostatic microwave measurements. Part 2 : The time domain approach., Astronomy & Astrophysics, Vol. 674, art. A73, june 2023

Part I - https://doi.org/10.1051/0004-6361/202244777

Part II - https://doi.org/10.1051/0004-6361/202244778

Partenariat : Cette recherche est le résultat d’un travail collaboratif entre des chercheurs du département de Mathematics and Statistics de l’Université de Tampere(Liisa-Ida Sorsa, Sampsa Pursiainen, Yusuf Oluwatoki Yusuf) et des chercheurs de l’équipe HIPE à l’Institut Fresnel (Astrid Dufaure, Christelle Eyraud, Jean-Michel Geffrin).

Que le Centre de Calcul Intensif d’Aix-Marseille et le CSC - IT Center for Science Ltd. soient ici remerciés pour l’accès à leurs ressources de calcul à haute performance. Nous remercions aussi le Centre Commun de Ressources en Microonde de nous avoir permis d’utiliser leur chambre anéchoïque entièrement équipée. Les chercheurs finlandais bénéficient du soutien du Centre d’excellence en modélisation inverse et imagerie (Académie de Finlande 2018-2025, numéro de projet 312341) et de l’Académie de Finlande, numéro de projet 336151.

Contact Chercheur : Christelle EYRAUD – Équipe HIPE, Institut Fresnel.

Une combinaison d’essais acellulaires et d’études en cellules permet de mieux comprendre l’organisation et la fonction des septines humaines.
Ces travaux sont publiés dans le Journal of Cell Biology.

Un système rapporteur basé sur la fluorescence qui sonde les interactions spécifiques septine-septine révèle que les septines humaines dans les cellules s’organisent en filaments qui ancrent les fibres d’actine à la membrane cellulaire.

Les septines constituent une famille de protéines impliquées dans un large spectre de processus biologiques, de la division cellulaire à la motilité cellulaire et à la morphogenèse des tissus animaux. En physiopathologie humaine, un rôle des septines a été établi dans les neuropathies, l’infertilité et la tumorigenèse. Malgré leurs rôles essentiels, la façon dont les septines humaines s’organisent et fonctionnent dans les cellules reste mal comprise. Un travail collaboratif entre des biologistes de l’Institut Fresnel et du Centre de Recherche en Cancérologie de Toulouse (CRCT) et des physiciens de l’Institut Fresnel et de TU Delft (Martins et al. 2022) aborde cette question en combinant des études cellulaires avec des essais de reconstitution in vitro. En développant un système rapporteur basé sur la fluorescence comme signature moléculaire des interactions spécifiques septine-septine, les auteurs montrent que toutes les septines décorant les fibres d’actine dans les cellules s’organisent en filaments. Empêcher la polymérisation des septines compromet l’intégrité des fibres d’actine et réduit la rigidité des cellules. Des mesures de distance à résolution nanométrique ont également montré que les filaments de septine sont liés à la membrane. Enfin, des essais de reconstitution ont montré que les filaments de septine ancrent l’actine à la membrane. Cette étude montre que l’organisation des septines en filaments est essentielle à leur fonction d’ancrage et de stabilisation des filaments d’actine à la membrane plasmique.

Figure

Image de fluorescence de septines (vert) décorant des fibres d’actine (magenta) dans des cellules adhérentes humaines. Le schéma en bas montre le modèle de travail basé sur les résultats de cette étude. Les septines s’organisent en filaments qui ancrent les fibres d’actine à la membrane cellulaire.

Référence : Human septins organize as octamer-based filaments and mediate actin-membrane anchoring in cells, Carla Silva Martins, Cyntia Taveneau, Gerard Castro-Linares, Mikhail Baibakov, Nicolas Buzhinsky, Mar Eroles, Violeta Milanović, Shizue Omi, Jean-Denis Pedelacq, François Iv, Léa Bouillard, Alex Llewellyn, Maxime Gomes, Mayssa Belhabib, Mira Kuzmić, Pascal Verdier-Pinard, Stacey Lee, Ali Badache, Sanjay Kumar, Cristel Chandre, Sophie Brasselet, Felix Rico, Olivier Rossier, Gijsje H. Koenderink, Jerome Wenger, Stéphanie Cabantous, Manos Mavrakis in Journal of Cell Biology, 2022

 https://doi.org/10.1083/jcb.202203016

Contact : Manos MAVRAKIS - équipe MOSAIC - manos.mavrakis@univ-amu.fr

Partenaires : Cette recherche est le fruit d’une collaboration entre l’Institut Fresnel, le Centre de Recherche en Cancérologie de Toulouse (CRCT), le Laboratoire Adhésion et Inflammation (LAI), l’Institut Interdisciplinaire de Neurosciences (IINS), l’Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale (IPBS), le Centre de Recherche en Cancérologie de Marseille (CRCM), l’Institut de Mathématiques de Marseille (I2M), TU Delft, l’Université Monash et UC Berkeley.

Financements : Cette recherche a reçu plusieurs financements
 de l’Agence Nationale de la Recherche (subventions ANR-17-CE13-0014 SEPTIMORF. ; ANR-17-CE09-0026-01 AntennaFRET ; ANR-20-CE42-0003 3DPolariSR)
 de la Fondation ARC pour la recherche sur le cancer (subvention ARCDOC42020010001242) et des Cancéropôles PACA et INCa
 du Conseil Européen de la Recherche (ERC) dans le cadre du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’UE (subventions n° 723241 et n° 772257) et de l’Union Européenne (subvention H2020-MSCA-ITN-2018 n°812772).
 de l’Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO/OCW) (subvention Gravitation ’BaSyC-Building a Synthetic Cell’ (024.003.019)

Obtention de la sensibilité ultime de détection UV des protéines

Débloquer le potentiel de la détection de protéines sans marquage : atteindre la sensibilité ultime avec l’autofluorescence UV et la nanophotonique

Les protéines sont naturellement fluorescentes dans l’ultraviolet, ce qui offre une approche attrayante pour étudier des protéines natives sans introduire des marqueurs fluorescents externes. L’autofluorescence UV des protéines se base sur la présence d’acides aminés tryptophane, généralement présents en faible nombre dans une protéine (en moyenne de 1 à 5 tryptophane par protéine). Cependant, en raison de signaux faibles et de fonds importants dans les UV, la technologie actuelle était limitée aux grosses protéines contenant plusieurs dizaines de tryptophanes. La grande majorité des protéines restait bien en deçà de la sensibilité de détection pour la détection d’une seule protéine sans marquage.

Une équipe de chercheurs de l’Institut Fresnel franchit cette limite de sensibilité et réalise une détection par autofluorescence UV sans marqueur jusqu’au niveau du tryptophane unique. L’approche repose sur une combinaison rationnelle de nanoantennes plasmoniques, d’antioxydants et de techniques de réduction du bruit de fond pour améliorer le rapport signal sur fond de plus d’un ordre de grandeur. Atteindre la sensibilité ultime de la technique UV-FCS jusqu’au régime du tryptophane unique a de nombreuses applications pour diverses communautés, de la nanophotonique à la biochimie.

Notre équipe démontre de manière concluante la spectroscopie de corrélation de fluorescence UV (UV-FCS) sur des protéines avec un seul résidu de tryptophane. Cela ouvre l’applicabilité de l’UV-FCS à une large bibliothèque de milliers de protéines, qui restaient auparavant inaccessibles (plus de 90 % des protéines humaines ont au moins un résidu de tryptophane, mais seulement 4 % ont plus de 20 tryptophanes). La spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS) et les techniques associées ont un impact important sur la biophysique moléculaire dans l’évaluation des propriétés de diffusion, des concentrations locales ou des taux de réactions cinétiques.

L’approche de maximisation du signal intéresse un large éventail de scientifiques et d’ingénieurs travaillant avec la fluorescence, la photonique ou la plasmonique. Notre article détaille plusieurs aspects multidisciplinaires : (i) éléments nanophotoniques plasmoniques pour améliorer la fluorescence, (ii) antioxydants pour neutraliser les espèces réactives de l’oxygène omniprésentes dans l’ultraviolet et (iii) suppression du fond basée sur une compréhension rationnelle de ses origines physiques.

Référence : Prithu Roy, Jean-Benoît Claude, Sunny Tiwari, Aleksandr Barulin, and Jérôme Wenger, “Ultraviolet Nanophotonics Enables Autofluorescence Correlation Spectroscopy on Label-Free Proteins with a Single Tryptophan” Nano Letters 2023

 https://doi.org/10.1021/acs.nanolett.2c03797

Financements : Ce projet a reçu un financement du Conseil européen de la recherche (ERC) dans le cadre du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne (accord de subvention n° 723241 TryptoBoost).

Contact Chercheur : Jérôme Wenger – Équipe MOSAIC, Institut Fresnel, Marseille - www.jeromewenger.com

La vie à haute température observée sous chauffage laser

Au fond des océans ou près des sources volcaniques, des micro-organismes ont su évoluer pour apprendre à vivre jusqu’à des températures extrêmes, même au-delà de 100°C. Observer ces organismes hyperthermophiles à de si hautes températures sous un microscope optique est une gageure. C’est pourtant la seule façon d’étudier leur métabolisme et leurs interactions.

Des chercheurs de l’Institut Fresnel (CNRS, Marseille) et de l’Institut de Biologie Intégrative de la Cellule (I2CB, université Paris-Saclay, Gif-sur-Yvette) ont mis au point une technique simple qui permet d’observer des hyperthermophiles vivre par microscopie optique haute résolution. La technique consiste à cultiver ces micro-organismes sur une lamelle de verre couvertes de nanoparticules d’or, et chauffer ces nanoparticules par une illumination laser. L’absorption intense des nanoparticules permet d’atteindre des températures arbitrairement élevées avec de faibles puissances laser. Cette technique est applicable sur n’importe quel microscope optique utilisé en biologie, et ne requiert pas l’implémentation d’un caisson chauffant. Elle nécessite juste l’utilisation d’une technique de microscopie de phase quantitative, pour cartographier la température aux petites échelles.

Dans un article publié dans Nature Communications, les chercheurs de l’institut Fresnel et de l’I2BC expliquent comment ils ont pu observer pour la première fois la bactérie Geobacillus stearothermophilus se diviser, nager, germiner, et étudier précisément sa vitesse de croissance en fonction de la température.

Ces travaux ouvrent la voie à l’étude de micro-organismes hyperthermophiles par une plus large communauté de biologistes, notamment celle de la bio-imagerie optique, en plein essor aujourd’hui, animée par le développement constant de nouvelles techniques de microscopies optiques permettant d’étudier le vivant à des échelles qui avoisinent le nanomètre, et en 3 dimensions.

Germination de bactéries thermophiles (Geobacillus stearothermophilus) à partir de spores micrométriques observée par microscopie de front d’onde, et activée par chauffage laser de nanoparticules d’or à 58°C

Référence : Molinaro, C., Bénéfice, M., Gorlas, A. et al. Life at high temperature observed in vitro upon laser heating of gold nanoparticles. Nat Commun 13, 5342 (2022)
 https://doi.org/10.1038/s41467-022-33074-6

Financements : Projet européen ERC HiPhore

Contact : Guillaume Baffou

Voir l’émission intrinsèque d’une seule protéine avec des antennes optiques ultraviolettes

Une nouvelle plate-forme d’antenne optique pour la détection sans marquage de protéines uniques dans l’UV avec des résolutions et une sensibilité sans précédent

L’un des objectifs ultimes de la biologie moléculaire est d’observer le fonctionnement des protéines individuelles dans leur état natif. Cependant, l’approche courante actuelle de la fluorescence à molécule unique repose sur l’introduction de marqueurs fluorescents externes qui peuvent entraîner des problèmes affectant les résultats expérimentaux. Comme alternative au marquage par fluorescence, travailler dans l’ultraviolet est séduisant pour profiter de l’autofluorescence naturellement présente dans la grande majorité des protéines. Cependant, les protéines émettent des ordres de grandeur moins que les colorants fluorescents conventionnels, de sorte que la détection UV d’une seule protéine est restée un défi jusqu’à présent.

Dans une publication récente dans Nature Communications, des chercheurs de l’Institut Fresnel présentent une nouvelle plate-forme d’antenne optique pour la détection sans marquage de protéines uniques dans l’UV avec des résolutions et une sensibilité sans précédent. L’approche combine (i) un réflecteur conique pour la collecte de fluorescence à des angles ultra-élevés avec (ii) une nano-ouverture métallique pour l’amélioration de la fluorescence et la réduction du bruit de fond. Pour démontrer expérimentalement l’utilité de notre approche et son application directe aux défis biochimiques, la détection en temps réel de l’autofluorescence UV à partir de protéines uniques immobilisées et diffusantes est démontrée, ainsi que des expériences surveillant la dénaturation d’une protéine. Fait important pour les applications biochimiques, toutes les expériences sur une seule molécule sont réalisées sur des protéines sans marquage et dans des conditions physiologiques, ce qui est unique dans ce domaine scientifique.

Les antennes optiques UV ouvrent une nouvelle forme de spectroscopie permettant l’étude de protéines individuelles dans leur état natif et en temps réel. Ce travail fournit un saut vers la conception d’essais biochimiques avec une résolution de protéine unique sans marquage ainsi que des nanosources optiques brillantes.

Antenne optique pour voir des protéines individuelles sans marquage dans l’ultraviolet.
Optical horn antenna for single label-free protein detection in the ultraviolet.

Référence : "Ultraviolet optical horn antennas for label-free detection of single proteins" ; A. Barulin, P. Roy, J.-B. Claude, J. Wenger, Nature Communications, 5 avril 2022

 https://doi.org/10.1038/s41467-022-29546-4

Financements : Ce projet a reçu un financement du Conseil européen de la recherche (ERC) dans le cadre du programme de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne (accord de subvention n° 723241 TryptoBoost).

Contact Chercheur : Jérôme Wenger – Équipe MOSAIC, Institut Fresnel, Marseille - www.jeromewenger.com

 Article sur le site de l’INSIS : "Observer une protéine unique sans marqueur grâce à une antenne optique dans l’ultra-violet"

Révéler l’organisation de l’actine dans les Cellules par l’orientation de molécules isolées

Une nouvelle approche d’imagerie polarisée à base de localisation de molécules isolées fluorescente permet de révéler l’organisation de l’actine dans les cellules aux échelles nanométriques

Imager la manière dont sont orientées les protéines en 3D dans une cellule, tout en les positionnant à des dizaines de nanomètre de précision, est un défi pour l’imagerie optique. C’est pourtant ce qui permettrait de comprendre les processus qui relient les conformations et organisation des protéines, aux fonctions qu’elles exercent dans les cellules. Alors que quelques méthodes émergent aujourd’hui pour mesurer à la fois la position et l’orientation de molécules uniques fluorescentes dans des échantillons in vitro, ces approches sont encore limitées pour l’utilisation dans des environnements complexes comme les cellules, où les conditions de signal à bruit et de fond de fluorescence sont délicates. Une des raisons principales est que ces approches se basent sur un codage de l’information de l’orientation moléculaire dans la forme de l’image de chaque molécule, forme qui peut dépendre fortement des aberrations optiques produites dans le microscope et par l’échantillon. Les chercheurs de l’équipe MOSAIC de l’Institut Fresnel sont parvenus à mettre en place une stratégie basée uniquement sur une mesure de rapports d’intensités d’une même molécule, projetée sur quatre directions de polarisation. En concevant un système de détection optique de telle manière que ces signaux sont peu dépendants des paramètres qui pourraient biaiser les données, les chercheurs ont montré la possibilité de remonter à l’information de l’orientation de molécules marquant l’actine, un filament du cytosquelette des cellules. Ces filaments, par leur densité, sont parfois impossible à isoler sur une image, même super–résolue. Grâce à cette détection polarisée, il a été possible de mettre en évidence la manière dont les filaments s’organisent avec des orientations soit fortement parallèles, comme dans les fibres de stress, soit dans des distributions beaucoup plus complexes mais spécifiques comme dans le front de migration des cellules où l’actine est agencée de manière singulière. Ces images, bien qu’étant mesurées dans des conditions optiques donc compatible avec le vivant, se rapprochent d’une imagerie structurale, révélant la manière dont les protéines s’organisent à des échelles nanométriques.

Cette nouvelle approche, appelée 4polar-STORM (pour Stochastic Optical Reconstruction Microscopy polarisée sur 4 voies), est basée sur un lien étroit entre l’orientation du marqueur fluorescent et celle de la protéine qu’ils rapportent. En développant une ingénierie des liaisons entre les marqueurs fluorescents et ces protéines, il sera possible dans le futur de suivre, dans des échantillons vivants, la manière dont ces protéines modifient leur orientation au cours du temps. L’approche de microscopie super-résolue polarisée vient donc compléter l’imagerie super-résolue de fluorescence pour aborder de nouvelles questions en biologie sous un angle différent.

Référence : V C. Rimoli, C. Valades Cruz, V. Curcio, M. Mavrakis, S. Brasselet. 4polar-STORM polarized super-resolution imaging of actin filament organization in cells. Nat. Communications 13, 301 (2022)

 https://doi.org/10.1038/s41467-022-27966-w

Financements : France BioImaging National Infrastructure (ANR-10-INBS-04), CENTURI convergence institute (ANR-16-CONV-0001), ANR SEPTIMORF (ANR-17-CE13-0014), ANR 3DPolariSR (ANR-20-CE42-0003). A*MIDEX (ANR-11-IDEX-0001), European Union’s Horizon 2020 research and innovation programme under the Marie Sklodowska-Curie (grant agreement No 713750), INRIA (projet NAVISCOPE-IPL).

Contact Chercheurs : Sophie Brasselet and Manos Mavrakis – Equipe MOSAIC, Institut Fresnel, Marseille

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Faits Marquants 2010

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Faits Marquants 2011

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Faits Marquants 2022