Malavika Kayyil soutiendra sa thèse intitulée« Exploring and improving fluorescence correlation spectroscopy (FCS) sensitivity from nanoprobe to label-free proteins for biosensing and nanopore applications. » le Jeudi 29 janvier 2026 à 13h30 en salle Pierre Cotton de l’Institut Fresnel, campus St Jérôme, Marseille. La soutenance se fera en anglais.
Membres du Jury :
– Dr. Thomas PONS, LPEM, INSERM, Paris, Rapporteur
– Dr. Karen PERRONET, LuMIn, CNRS, Gif sur Yvette, Rapporteur
– Dr. Serge MONNERET, Institut Fresnel, CNRS, Marseille, Examinateur
– Prof. Antoine DELON, LIPhy, University of Grenoble Alpes, Président du Jury
– Dr. Jérôme WENGER, Institut Fresnel, CNRS, Marseille, Directeur de Thèse
Résumé : La spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS) est une technique puissante et polyvalente qui analyse les fluctuations d’intensité de fluorescence au sein d’un petit volume afin de révéler des processus moléculaires dynamiques tels que la diffusion, les réactions chimiques et les changements conformationnels. Elle est devenue un outil précieux en physique, chimie et biologie. Cependant, certains facteurs limitent la FCS, comme le bruit de fond, le chevauchement spectral, le photoblanchiment et le marquage hétérogène. Cette thèse explore des stratégies pour réduire ces limitations et améliorer la sensibilité et la limite de détection de la FCS. Elle débute par une introduction à la technique et offre un aperçu général de ses applications, avantages et limitations. Nous explorons ensuite la capacité de la FCS à étudier la photophysique de nanoparticules telles que des nano-agrégats d’or et des nanoparticules de lanthanides à l’échelle de la particule unique. Ceci peut s’avérer complexe en raison de leur longue durée de vie, entraînant une faible luminosité et une saturation précoce. Enfin, nous explorons la spectroscopie de corrélation de durée de vie de fluorescence (FLCS), une variante de la FCS qui utilise l’information sur la durée de vie de fluorescence pour distinguer la contribution des émetteurs et du bruit de fond. La technique FLCS permet de surmonter le chevauchement spectral et de réduire considérablement le bruit de fond, améliorant ainsi le rapport signal/bruit (RSB). Nous avons étudié la capacité de multiplexage de la FLCS dans un mélange ternaire de trois composants présentant des spectres d’émission se chevauchant. Nous avons ensuite exploré la limite de détection de la FLCS dans la gamme des faibles concentrations et déterminé les paramètres responsables de cette limite. Nous avons également introduit un facteur de correction FLCS afin d’améliorer encore la limite de détection. Nous avons utilisé ces connaissances pour estimer la constante de vitesse d’association de l’interaction streptavidine-biotine. Le marquage des protéines est connu pour induire des dommages structuraux et fonctionnels. Par conséquent, dans la dernière partie, nous nous sommes intéressés à l’UV profond et nous nous sommes concentrés sur la détection de protéines sans marquage, en utilisant l’autofluorescence intrinsèque des résidus d’acides aminés aromatiques. Nous avons discuté des limitations de la microscopie UV et de l’importance de la stabilisation du tampon et des antioxydants pour les atténuer. Nous avons également montré comment l’optimisation des conditions de solvant et de la configuration du microscope confocal peut améliorer la limite de détection de la streptavidine sans marquage. Nous avons également constaté que l’agitation de l’échantillon permet de réduire considérablement le photoblanchiment et d’améliorer la luminosité de la streptavidine. Cette luminosité accrue a été utilisée pour comprendre la coopérativité streptavidine-biotine. Étant donné que toutes les techniques présentées manquent de spécificité pour identifier la protéine, nous avons également proposé une perspective future d’utilisation de nanopores plasmoniques basée sur une stratégie de lecture optique. Notre approche visant à limiter le bruit de fond et à améliorer la photostabilité des protéines pourrait s’avérer utile pour les applications des nanopores. En conclusion, cette thèse présente différentes stratégies pour surmonter les limitations de la spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS)
et améliorer la sensibilité de la technique pour les applications de biodétection. Cette approche peut être utile pour l’étude d’émetteurs faiblement fluorescents et de concentrations extrêmement faibles avec un faible rapport signal/bruit.
Mots Clés : Spectroscopie de corrélation de fluorescence (FCS), Spectroscopie de corrélation de durée de vie de fluorescence (FLCS), Détection de molécules uniques, Autofluorescence UV, Microscopie confocale, Nanopores
