Le développement de nouvelles techniques d’imageries microscopiques pour la biologie amène de nouveaux besoins en termes de traitement, d’analyse et de caractérisation des précisions.
Imagerie par génération de seconde harmonique résolue en polarisation (PSHG) :
Analyse des méthodes d’estimation des paramètres d’orientation moléculaires en imagerie PSHG, en collaboration avec l’équipe MOSAIC :
Détermination des précisions d’estimation de ces paramètres d’orientation, à l’aide de la Borne de Cramer Rao [1,5]
Caractérisation d’un nouvel algorithme d’estimation non itératif [1] dans le cas d’une répartition à symétrie cylindrique des diffuseurs.
Caractérisation et comparaison de différentes stratégies d’acquisitions [2].
Développement d’une technique de détection a posteriori des mesures aberrantes [6], dans le cadre du projet Codim du défi Imag’In 2015 (Mission pour l’Interdisciplinarité du CNRS).
Voir : Polarized Microscopy.
[1] Ph. Réfrégier, M. Roche and S. Brasselet, Precision analysis in polarization-resolved second harmonic generation microscopy, Optics Letters, Vol. 36 (11), pp. 2149-2151, 2011
[2] Ph. Réfrégier, M. Roche, J. Duboisset and S. Brasselet, Precision increase with two orthogonal analyzers in polarization-resolved second-harmonic generation microscopy, Optics Letters, Vol. 37 (20), pp. 4173-4175, 2012
[3] J. Duboisset, D. Aït-Belkacem, M. Roche, H. Rigneault and S. Brasselet, Generic model of the molecular orientational distribution probed by polarization-resolved second-harmonic generation, Phys. Rev. A 85, 043829, 2012
[4] Microscopic structural study of collagen aging in isolated fibrils using polarized second harmonic generation,
D. Aït-Belkacem, M. Guilbert, M. Roche, J. Duboisset, P. Ferrand, G. Sockalingum, P. Jeannesson and S. Brasselet, J. Biomed. Opt. 17(8), 080506, 2012
[5] V. Wasik, Ph. Réfrégier, M. Roche and S. Brasselet, Precision of polarization-resolved second harmonic generation microscopy limited by photon noise for samples with cylindrical symmetry, Journal of the Optical Society of America A, Vol. 32 (8), pp.1437-1445, 2015
[6] V. Wasik, F. Galland, S. Brasselet, H. Rigneault, and Ph. Réfrégier, Detection of imprecise estimations for polarization-resolved second-harmonic generation microscopy, Journal of the Optical Society of America A, Vol. 33 (7), pp. 1353-1362, 2016
Imagerie optique super-résolue STORM (STochastic Optical Reconstruction Microscopy) :
Localisation et suivi de particules uniques, en collaboration avec l’équipe MOSAIC et le Centre d’Immunologie de Marseille Luminy (CIML) et dans le cadre du projet ANR NanoDigicode et de l’AMIDEX LightInBio.
Localisation de particules uniques résolues en polarisation [1,2].
Suivi automatique de cellules pour l’analyse de la réponse au calcium des cellules T [3] (dépôt d’une licence logicielle [4]).
Performances de reconstruction de la position des particules à haute densité de particules [5] et conception du logiciel UNLOC (licence gratuite pour un usage universitaire) adapté aux hautes densités de particules, sans paramètre à régler, rapide et permettant d’estimer non seulement la position et l’intensité des particules, mais également l’ordre de grandeurs des erreurs de positionnement en fonction de la densité de particules.
[1] Shaban, H.A. and Valades-Cruz, CA. and Savatier, J. and Monneret, S. and Rigneault, H. and Bertaux, N. and Brasselet, S., Polarized Resolved Single-Molecule Localization-Based Super-Resolution Fluorescence Microscopy Reveals Orientation Order in Bio-Molecular Assemblies, BIOPHYSICAL JOURNAL, Vol. 106(2), pp.203A-204A, 2014
[2] Cruz, C. and Shaban, H.A. and Kress, A. and Bertaux, N. and Monneret, S. and Mavrakis, M. and Savatier, J. and Brasselet, S., Quantitative nanoscale imaging of orientational order in biological filaments by polarized superresolution microscopy, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (PNAS), Vol. 113(7), pp.E820-E828, 2016
[3] Salles, A. and Billaudeau, C. and Sergé, A. and Bernard, A-M. and Phélipot, M-C. and Bertaux, N. and Fallet, M. and renot, P. and Marguet, D. and He, H-T. and Hamon, Y., Barcoding T cell calcium response diversity with Methods for Automated and Accurate Analysis of Cell Signals (MAAACS), PLOS Computational Biology, Vol. 9, pp.e1003245, 2013
[4] Licence logiciel MAAASC [3] n°DA14290/HAMON/AF,
IDDN.FR.001.420018.000.S.C.2014.000.31230
[5] Sebastien Mailfert, Jérôme Touvier, Lamia Benyoussef, Roxane Fabre, Asma Rabaoui, Marie-Claire Blache, Yannick Hamon, Sophie Brustlein, Serge Monneret, Didier Marguet, Nicolas Bertaux, A Theoretical High-Density Nanoscopy Study Leads to the Design of UNLOC, a Parameter-free Algorithm, Biophysical Journal, Vol.115, pp. 565 - 576, 2018
Imagerie Raman comprimée :
L’imagerie Raman comprimée consiste à mesurer, non plus un spectre Raman complet, mais les nombres de photons détectés dans des sommes de bandes spectrales. Cela revient à filtrer optiquement les spectres avec des filtres binaires, c’est-à-dire dont les coefficients pour chaque bande spectrale sont soit égaux à 1 soit égaux à 0.
Différents travaux sur les méthodes statistiques appliquées à l‘imagerie Raman comprimée sont conduits (en collaboration avec l’équipe Mosaic) :
Optimisation des filtres et caractérisation des performances de la technique Raman comprimée pour l’estimation de concentrations [1] et pour la classification d’espèce [2] : les paramètres essentiels qui caractérisent la difficulté de la tâche à accomplir ont été obtenus en analysant les bornes de Cramer Rao et de Bhattacharyya.
Définition d’un nouveau protocole de mesures qui permet de réaliser les classifications avec une erreur maitrisée et bornée, indépendamment de l’intensité du spectre analysé qui peut être variable dans les échantillons étudiés [3], et avec la possibilité d’effectuer un nombre de mesures inférieur au nombre de classes à discriminer (ce qui n’était pas le cas avec les techniques développées auparavant).
Nouvelle approche pour l’optimisation des filtres binaires dans laquelle les filtres sont modifiés entre chaque pixel d’une image [4], de sorte qu’il soit possible d’effectuer une classification des espèces en chaque pixel avec de bonnes performances mais très peu de mesures, et de également de reconstruire un spectre Raman complet en combinant les mesures faites en différents pixels d’une même classe.
[1] Ph. Réfrégier, C. Scotté, H.B. De Aguiar, H. Rigneault and F. Galland, Precision of proportion estimation with binary compressed Raman spectrum, Journal of the Optical Society of America A, Vol. 35 (1), pp. 125-134, 2018.
[2] Ph. Réfrégier and F. Galland, Bhattachryya bound for Raman spectrum classification with a couple of binary filters, Optics Letters, Vol. 44 (9), pp. 2228-2231, 2019.
[3] Ph. Réfrégier, E. Chevallier and F. Galland, Compressed Raman classification method with upper bounded error probability, Optics Letters, Vol. 44 (23), pp. 5836-5839, 2019.
[4] T. Justel, F. Galland and A. Roueff, Compressed Raman method combining classification and estimation of spectra with optimized binary filters, Optics Letters, Vol. 47 (5), pp. 1101-1104, 2022.
Microscopie adaptative pour l’imagerie des surfaces biologiques :
Ces travaux, menés en collaboration avec l’équipe Mosaic, concernent la réduction de la phototoxicité en microscopie de fluorescence pour le vivant, dans le cas où les cellules observées sont réparties en une couche unicellulaire qui forme une surface 2D courbée dans l’espace :
développement d’une stratégie d’acquisition adaptative pilotée par algorithmes de traitement temps réel des données (smartscan), afin d’estimer la surface sur laquelle sont localisées les cellules d’intérêt, permettant de réduire fortement le nombre de points illuminés dans l’échantillon par rapport à une acquisition complète du volume 3D [1] (+2 brevets [2,3]).
optimisation du nombre et de la répartition des acquisitions, fondée sur une analyse des bornes de Cramer Rao, pour l’estimation de la position d’une interface fluorescente à budget de photons constant [4].
[1] F. Abouakil, H. Meng, M.-A. Burcklen, H. Rigneault, F. Galland, L. LeGoff, An adaptive microscope for the imaging of biological surfaces, Light : Science & Applications, Vol. 10, Article number : 210, 2021.
[2] L. LeGoff, H. Rigneault, F. Galland, Smart Scan Présomptif, brevet n°FR2107819, déposé le 20/07/2021 (CNRS, Aix-Marseille Univ, Ecole Centrale Marseille)
[3] L. LeGoff, H. Rigneault, F. Galland, Smart Scan Propagatif, brevet n°FR2107822, déposé le 20/07/2021 (CNRS, Aix-Marseille Univ, Ecole Centrale Marseille)
[4] M.-A. Burcklen, F. Galland and L. Le Goff, Optimizing sampling for surface localization in 3D-scanning microscopy, Accepted for publication in JOSAA, 2022.
ResearchGate
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