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Microscopie de fluorescence

La microscopie de fluorescence dans le domaine du visible est un outil très utilisé en biologie car très adaptée à l’étude de cellules vivantes.

Malheureusement la résolution de cette technique d’imagerie est limitée par le processus de diffraction et au mieux la résolution latérale est de 200 nm. Dans l’équipe SEMO nous développons un système d’imagerie optique simple offrant une résolution inférieure à 100 nm.

Notre système d’imagerie repose sur deux idées principales. La première consiste à graver la lamelle sur laquelle est déposé l’échantillon de façon à créer un réseau nanostructuré ; ce réseau transforme l’onde incidente en ondes évanescentes de très hautes fréquences spatiales qui peuvent sonder les détails les plus fins de l’échantillon.

La seconde idée est d’illuminer cette lamelle avec un faisceau contrôlé spatialement en amplitude et en phase. Selon le mode d’éclairement, on peut soit créer une grille de lumière, soit déplacer de façon continue à la surface du réseau un spot lumineux de taille inférieure à la limite de diffraction.
Ce système permettra, grâce à la grille de lumière, de faire de l’imagerie large-champ ultra-résolue et, avec le spot, d’étudier des phénomènes dynamiques par Spectroscopie de Corrélation de Fluorescence.

Nous avons également montré qu’en éclairant l’échantillon de manière hétérogène et aléatoire, il est possible d’améliorer la résolution du microscope d’un facteur deux. Notre approche consiste à enregistrer plusieurs images d’un même échantillon en l’éclairant avec des motifs lumineux aléatoires (speckle) obtenus en bougeant un morceau de plastique rugueux sur le trajet d’un faisceau laser. Un algorithme d’inversion est ensuite utilisé pour reconstruire l’échantillon à partir des images.

L’intérêt de notre approche par rapport aux autres techniques de microscopie super-résolue (comme la microscopie confocale ou la microscopie à éclairement structuré ...) est qu’il n’est pas besoin de contrôler l’éclairement. Cela permet de simplifier grandement la mise en oeuvre expérimentale.

Références :

E. Mudry, K. Belkebir, J. Girard, J. Savatier, E. Le Moal, C. Nicoletti, M. Allain and A. Sentenac, Structured illumination microscopy using unknown speckle patterns, Nature Photonics 6, 312 (2012).
A. Sentenac, K. Belkebir, H. Giovannini and P. C. Chaumet, High resolution Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy using periodically nanostructured glass slides, J. Opt. Soc. Am. A 26, 2550 (2009).
A. Sentenac, K. Belkebir, H. Giovannini and P. C. Chaumet, Sub-diffraction resolution in total internal reflection fluorescence microscopy with a grating substrate, Opt. Lett. 33, 255 (2008).

Microsocopie de fluorescence (Projet SOURIS)

L’objectif du projet de Sonde Optique Ultra-résolue pour l’Imagerie de Surface est de développer un système d’imagerie optique simple offrant une résolution inférieure à 100 nm et particulièrement adapté à l’étude des cellules vivantes. Les techniques optiques actuelles qui permettent d’obtenir une résolution en deçà de la limite de diffraction de la lumière (< 200 nm) sont encore lourdes, difficiles à mettre en oeuvre et parfois intrusives. Notre système d’imagerie repose sur deux idées principales. La première consiste à graver la lamelle sur laquelle est déposé l’échantillon de façon à créer un réseau nanostructuré ; ce réseau transforme l’onde incidente en ondes évanescentes de très hautes fréquences spatiales qui peuvent sonder les détails les plus fins de l’échantillon. La seconde idée est d’illuminer cette lamelle avec un faisceau contrôlé spatialement en amplitude et en phase. Selon le mode d’éclairement, on peut soit créer une grille de lumière, soit déplacer de façon continue à la surface du réseau un spot lumineux de taille inférieure à la limite de diffraction. Ce système permettra, grâce à la grille de lumière, de faire de l’imagerie large-champ ultra-résolue et, avec le spot, d’étudier des phénomènes dynamiques par Spectroscopie de Corrélation de Fluorescence. La première application envisagée est l’imagerie de membranes plasmiques de cellules vivantes.

Ce projet de recherche s’appuie sur des travaux théoriques et numériques de l’équipe SEMO et le savoir faire expérimentale de l’équipe MOSAIC. Pour plus de détais sur la partie expérimentale voire les pages de l’équipe MOSAIC. Ce projet profite d’un financement ANR.

Publications liées au projet Souris :

Articles :

A. Sentenac, K. Belkebir, H. Giovannini, P. C. Chaumet
High resolution Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy using periodically nanostructured glass slides
J. Opt. Soc. Am. A 26, 2550 (2009).
A. Sentenac, K. Belkebir, H. Giovannini, and P. C. Chaumet,
Sub-diffraction resolution in total internal reflection fluorescence microscopy with a grating substrate
Opt. Lett. 33, 255 (2008).

Conférences et posters :

J. Girard, G. Maire, H. Giovannini, K. Belkebir, P. C. Chaumet, A. Talneau, A. Sentenac : Optical diffraction tomography with a total internal reflection microscopy configuration. Focus on Microscopy 2009, 5-8 avril 2009, Cracovie (Pologne).
A. Sentenac, P. C. Chaumet, G. Maire, K. Belkebir, J. Girard, S. Monneret, H. Giovannini : Increasing the resolution of total internal fluorescence microscopes with periodic nanostructure. 8th International Photonic and Electromagnetic Crystal Structures Meeting, 5-9 avril 2009, Sydney.
A. Sentenac, P. C. Chaumet, G. Maire, K. Belkebir, J. Girard, S. Monneret, H. Giovannini : Periodic nanostructures for focusing light spots beyond the diffraction limit. 8th International Photonic and Electromagnetic Crystal Structures Meeting, 5-9 avril 2009, Sydney.